細菌形質転換ガイド: 遺伝子操作の科学

遺伝子操作の基礎である細菌の形質転換は、ワクチン開発、創薬、バイオテクノロジー研究の進歩に不可欠な細菌細胞への DNA 挿入を可能にします。


重要なポイント:

細菌の形質転換は、DNA とコンピテントセルを使用する遺伝子改変技術です。
ワクチン開発、創薬、バイオテクノロジーで使用されます。
形質転換効率が重要であり、コンピテントセルの種類、DNA 濃度、インキュベーション条件、および方法論に影響されます。
エレクトロポレーションとヒートショックは、コンピテントセルを作成する方法です。
パーセントで表される形質転換効率は、形質転換に成功した細胞の数を総細胞で割ることによって計算されます。
細菌の形質転換の概略図
細菌の形質転換は、細菌を遺伝子的に改変するために使用されるプロセスです。これはさまざまな方法で行うことができますが、最も一般的なのは、コンピテントセルの使用による DNA 媒介形質転換です。このガイドでは、形質転換効率の計算方法やそれに影響を与える要因など、細菌形質転換の基本について説明します。この強力な技術は、ワクチン開発、創薬、バイオテクノロジーなど、さまざまな用途に使用されています。


細菌の形質転換とは何ですか?


細菌の形質転換は、外来 DNA を細菌細胞に挿入するプロセスです。 DNA 媒介形質転換には、外来 DNA を取り込みやすくする方法で処理されたコンピテント セルが関与します。コンピテントセルが作成されたら、外来 DNA を加えて細胞をインキュベートします。その後、DNA は細胞に入り、細菌のゲノムに組み込まれます。このプロセスは、細菌に新しい遺伝子や突然変異を導入するために使用できます。


細菌の形質転換は、さまざまな目的に使用できる強力なツールです。最も一般的な用途の 1 つはワクチン開発です。病原体のDNAを細菌に導入することで、人間や動物にとって安全なワクチンを作ることが可能になります。この技術は新薬の開発にも使用できます。細菌に突然変異を導入することで、抗生物質に対して耐性を持つ株を作り出すことが可能です。これは、新しい抗生物質を作成したり、既存の薬の有効性をテストしたりするために使用できます。細菌の形質転換はバイオテクノロジーでも使用されます。このプロセスは、研究や産業で使用する酵素、ホルモン、その他のタンパク質の生産に使用できます。


細菌の形質転換に含まれる手順


pBlu プラスミドは、細菌の形質転換に使用できる市販のベクターです。このプラスミドにはβ-ガラクトシダーゼの遺伝子が含まれているため、β-ガラクトシダーゼを簡単に識別できます。 pBlu プラスミドには抗生物質耐性マーカーも含まれているため、抗生物質を含む寒天プレート上で形質転換細胞を選択できます。各プレート上の青色のコロニーは形質転換が成功したことを示し、青色のコロニーがない場合は形質転換が成功しなかったことを示します。 pBlu プラスミドでコンピテントセルを形質転換するには、以下の手順に従います。


ステップ / 手順

1.              エレクトロポレーションまたはヒートショックを使用してコンピテントセルを                      準 備します。
2.              DNAをコンピテントセルに添加し、37℃で30分間インキュベートします。 DNA                   は 0.01 ～ 0.05 ng/μl の濃度でコンピテントセルに添加する必要があります。
3.              抗生物質を含む寒天プレートに細胞をプレーティングします。
4.              プレートを 37°C で一晩インキュベートします。
5.             プレート上に形成されるコロニーの数を数えます。形質転換効率をパーセンテ                       ジとして計算します。


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変換効率はどのように計算されますか?


コンピテントセルは、細胞膜を外来 DNA に対してより透過性にするために遺伝子組み換えされた細菌細胞です。コンピテントセルは、エレクトロポレーションとヒートショックの 2 つの方法を使用して作成できます。エレクトロポレーションは、電場を使用して細胞の DNA 透過性を高めるプロセスです。ヒートショックでは、42℃に加熱したウォーターバス内で細胞をインキュベートします。

形質転換効率は、外来 DNA を取り込む細胞の数を細胞の総数で割ったものです。これは、抗生物質を含むプレートにコンピテントセルをプレーティングすることによって計算できます。コンピテントセルの形質転換効率を計算するには、寒天プレート上に形成されるコロニーの数を数える必要があります。これは、既知の数の細胞をプレーティングし、それらを一晩インキュベートすることによって行うことができます。次に、形質転換効率は、形成されたコロニーの数をプレーティングされた細胞の数で割ったものとして計算されます。形質転換効率は通常、パーセントで表されます。


変換効率に影響を与える要因は何ですか?


形質転換効率に影響を与える可能性のある要因は数多くあります。これらには、使用するコンピテントセルの種類、DNA 濃度、インキュベーション時間と温度、選択圧、および使用する方法が含まれます。


1.) コンピテントセル
コンピテントセルは細菌の形質転換を成功させる鍵となります。細胞の種類が異なれば、形質転換効率も異なります。たとえば、大腸菌コンピテントセルの形質転換効率は約 1,000 万分の 1 です。これは、100 万個の大腸菌細胞につき、外来 DNA を取り込むのは 1 つだけであることを意味します。


2.) DNA濃度
DNA 濃度も形質転換効率に影響を与える可能性があります。濃度が低すぎる場合、コンピテントセルは形質転換を成功させるのに十分な DNA を取り込むことができない可能性があります。濃度が高すぎると、コンピテントセルが DNA を取り込みすぎて過負荷になる可能性があります。


3.) インキュベーション時間と温度
インキュベーション時間と温度も重要な要素です。細胞を長時間インキュベートしすぎると、DNA が分解される可能性があります。温度が高すぎると細胞死につながります。最適なインキュベーション時間と温度は、使用するコンピテントセルの種類によって異なります。


4.) 選択圧力
選択のプレッシャーも重要な要素です。これは、形質転換細胞が増殖する条件を指します。選択圧が高すぎると、外来 DNA を取り込んだ細胞のみが生き残ることができます。これにより、形質転換効率が低下する可能性があります。


5.) 方法
コンピテントセルの作成に使用される方法は、形質転換効率に影響します。エレクトロポレーションはヒートショックよりも効率が高く、最大 90% の効率があります。ヒートショックの効率は低く、効率は約 50 ～ 70% です。


細菌の形質転換に使用できる市販のコンピテントセルが多数あります。 DH コンピテントセルは大腸菌 K12 株に由来し、形質転換効率は約 1,000 万分の 1 です。 XL-コンピテントセルは大腸菌XL-lacZ株に由来しており、形質転換効率は約1億分の1です。これらのコンピテントセルは、形質転換効率が高くなるように設計されています。これらのコンピテントセルの一部では、最大 90% の形質転換効率を達成できます。
28th Oct 2024 Sana Riaz

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