図1：サンドイッチELISAの概略図

サンドイッチELISAとは？

サンドイッチELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、抗体を利用してサンプル中の目的のタンパク質、ホルモン、または分析物の量を定量化する技術です。捕捉抗体と検出抗体は、タンパク質の非重複エピトープに結合してタンパク質を挟み込むため、サンドイッチELISAと呼ばれます。検出抗体添加の後、化学基質（TMBなど）を添加して、ELISAプレートリーダーで読み取ることができる比色シグナルを生成します。

サンドイッチELISA抗体

サンドイッチELISAの組み立てには、検出される特異性、感度、および分析対象物に応じて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用します。

> ポリクローナル抗体

ポリクローナル抗体は、多くの場合、サンプル中の可能な限り多くの検体をプルダウンするために使用されます。ポリクローナル抗体は複数のエピトープに対して結合するため、目的のタンパク質を捕捉するための機会が増加します。

> モノクローナル抗体

モノクローナル抗体は、単一の抗原をプルダウンできます。したがってタンパク質の微妙な違いを区別できます。また、モノクローナル抗体はポリクローナル抗体と比べ、データの一貫性が向上しています。

サンドイッチELISAの利点

長所	説明
サンプルの精製は不要	サンドイッチELISAは、精製を必要とせずに複雑なサンプルのタンパク質/分析物の測定を可能にします。
高い特異性	サンドイッチELISAは、精製を必要とせずに複雑なサンプルのタンパク質/分析物の測定を可能にします。
定量化	ウェスタンブロットなどの他の抗体を利用した方法と比較して、サンドイッチELISAではサンプル中のタンパク質の量を定量できます。

サンドイッチELISAキット

PharmaGenieサンドイッELISAキット

ELISA GenieのPharmaGenie ELISAキットは、製薬およびバイオテクノロジー研究のニーズを満たすように設計された高品質なELISAキットです。 PharmaGenie ELISAキットは、ISO 9001：2000品質システムに従って検証された高品質のモノクローナル抗体ペアと試薬に焦点を当てており、未来の発見に役立つ優れたキットです。

サンドイッチELISAビデオ

ELISA Genieでは、ヒト・マウス・ラットなどの因子をターゲットとしたサンドイッチELISAのプロトコルビデオを制作しました。このビデオはELISAプロトコル中で鍵となるステップについて言及しており、研究者が効率的にアッセイを行えるようにしています。プロトコルはELISAキットによって若干異なる場合があります。

サンドイッチELISAプロトコル

サンドイッチELISAアッセイは、研究者が血清、血漿、細胞上清、組織、その他の生体試料などのサンプルに含まれる目的のタンパク質を定量するのに役立ちます。サンドイッチELISAキットは、捕捉抗体がポリスチレン製ELISAプレート上に既にコーティングされているプレコートELISA、または自身でELISAサンドイッチアッセイを組み立てるために抗体ペアを購入する2つのタイプがあります。以下では、両方のプロトコルについて説明します。

サンプルの調製と回収

さまざまな種類のサンプルから、サンドイッチELISAでタンパク質/因子量を測定できます。

最良の方法に従ってタンパク質を抽出し、サンプル回収後できるだけ早く測定を実施します。または指定温度（-20°C / -80°C）で抽出物を保存し、最適な結果を得るために凍結融解の繰り返しを避けます。

血清：血清分離チューブを使用する場合、室温で30分間サンプルを凝固させます。その後1,000x gで10分間遠心します。血清画分を回収し、すぐに分析するか、サンプルを小分けして-80℃で保存します。凍結融解の繰り返しを避けてください。

血清分離チューブを使用しない場合は、2〜8℃でサンプルを一晩凝固させます。その後1,000x gで10分間遠心します。血清を回収し、すぐに分析するか、サンプルを小分けして-80℃で保存します。凍結融解の繰り返しを避けてください。

血漿：EDTAまたはヘパリンを抗凝固剤として使用して血漿を採取します。採取から30分以内に、サンプルを4°C、1000×gで15分間遠心します。血漿分画を回収し、すぐに分析するか、サンプルを小分けして-80℃で保存します。凍結融解の繰り返しを避けてください。注：過剰に溶血したサンプルは使用に適しません。

その他サンプルの種類については、サンプル収集ガイドをご覧ください。

サンドイッチELISA（プレコートタイプ）プロトコルの段階的な手順

図3：サンドイッチELISA（プレコートタイプ）のステップごとの概略図。まず、スタンダードを調製し、その後、ELISAプレートにサンプルを加えてインキュベートします。インキュベート後、プレートを洗浄し、標識抗体を加えて再度インキュベートします。インキュベート後、プレートを洗浄し、SABCワーキングソリューションを追加します。プレートを洗浄し、TMB基質を加えた後、インキュベーションします。最後に、反応停止液を加え、測定します。

ステップ	手順
1.	コート済のプレートにスタンダード、サンプル、およびコントロール（ゼロ）ウェルをそれぞれ設定し、それらの位置を記録します。各スタンダードとサンプルは2つのウェルで測定することをお勧めします。スタンダード、サンプル、コントロール（ゼロ）ウェルを追加する前にプレートを2回洗浄してください！
2.	スタンダードのウェルに分注した0.1mlのスタンダード溶液を添加します。
3.	0.1 mlのサンプル/標準希釈バッファーをコントロール（ゼロ）ウェルに追加します。
4.	希釈したサンプル（ヒト血清、血漿、組織ホモジネート、その他の生体液）0.1 mlをサンプルウェルに加えます。
5.	カバーでプレートを密封し、37℃で90分間インキュベートします。
6.	カバーを取り外してプレートの中身を捨てます。吸収性濾紙またはその他の吸収性材料の上でプレートをたたきます。ウェルは完全に乾燥させないでください。プレートを2回、ウォッシュバッファーで洗浄してください。
7.	0.1 mlのビオチン検出抗体入りワーキングソリューションを上記のウェル（スタンダード、テストサンプル、ゼロウェル）に添加します。側壁に触れることなく、各ウェルの底にソリューションを追加します。
8.	カバーでプレートを密閉し、37℃で60分間インキュベートします。
9.	カバーを取り外し、ウォッシュバッファーでプレートを3回洗浄します。各洗浄の間に1分間、ウォッシュバッファーをウェルに浸漬してください。
10.	0.1 mlのSABCワーキングソリューションを各ウェルに加え、カバーでプレートを密閉し、37℃で30分間インキュベートします。
11.	カバーを取り外し、プレートをウォッシュバッファーで5回洗浄します。洗浄の度に、ウォッシュバッファーをウェルに1〜2分間浸漬します。
12.	90 µlのTMB基質を各ウェルに加え、プレートを覆い、暗所かつ37℃で15〜30分インキュベートします（注：このインキュベーション時間は参考です。最適な時間は使用者が決める必要があります。）。スタンダードの青の色合いは、濃縮されている最初の3〜4ウェルで見ることができます。他のスタンダードでは明らかな色の変化はありません。
13.	50 µlの反応停止液を各ウェルに加え、完全に混合します。色がすぐに黄色に変わります。
14.	反応停止液を加えた直後の450 nmでの吸光度を、マイクロプレートリーダーで測定します。

サンドイッチELISA（組み立て型）プロトコルの手順

図4：ELISAキット（組み立て型）のステップごとの概略図。

捕捉抗体のプレートコーティング

ステップ	手順
1.	希釈した捕捉抗体100µlをすべてのウェルに加えます。
2.	プレートをカバーで覆い、4℃で一晩インキュベートします。
3.	カバーを取り外し、次のようにプレートを洗浄します。 a）各ウェルから液体を吸引します・ b） 0.3 mlの洗浄液を各ウェルに添加します。 c）各ウェルから液体を吸引します。 d）ステップbとcを繰り返します。
4.	すべてのウェルに100µlのブロッキングバッファーを加えます。
5.	プレートをカバーで覆い、室温（18〜25℃）で2時間インキュベートします。
6.	カバーを取り外し、次のようにプレートを洗浄します。 a）各ウェルから液体を吸引します。 b）0.3 mlの洗浄液を各ウェルに添加します。 c）各ウェルから液体を吸引します。 d）ステップbとcをさらに2回繰り返します。
7.	プレートをすぐに使用する場合は、次のセクションに進んでください。コーティング済およびブロッキング済プレートを今後の使用のために保管する場合、各プレートを室温（18〜25°C）で24時間ベンチ乾燥させます。その後、乾燥剤入りの密封されたビニール袋に2〜8℃で最大12か月保管できます。

組み立て型サンドイッチELISAプロトコル

ステップ	手順
1.	スタンダードカーブ（標準曲線）を準備します。
2.	各スタンダード、サンプル、ゼロ（スタンダード希釈バッファー）100µlを2つのウェルに添加します。
3.	希釈した検出抗体50μlをすべてのウェルに加えます。
4.	プレートをカバーで覆い、室温（18〜25℃）で1時間インキュベートします。
5.	カバーを取り外し、次のようにプレートを洗浄します。 a）各ウェルから液体を吸引します。 b）0.3 mlの洗浄液を各ウェルに添加します。 c）各ウェルから液体を吸引します。 d）ステップbとcを繰り返します。
6.	すべてのウェルにストレプトアビジン-HRP溶液100μlを添加します。
7.	プレートをカバーで覆い、室温（18〜25°C）で30分間インキュベートします。
8.	洗浄ステップ5を繰り返します。
9.	調製したTMB基質溶液100μlをすべてのウェルに加えます。
10.	暗所・室温で5～15分間、インキュベートします。光が当たらないよう、プレートをアルミホイルで包んでください。
11.	すべてのウェルに100μlの反応停止液を加えます。
12.	ステップ11のすぐ後、450 nmを主波長、630 nmを参照波長（オプション）で設定した分光光度計を用い、各ウェルの吸光度を読み取ります。参照波長は610 nm〜650 nmでも構いません。

検出とデータ解析

ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）とアルカリホスファターゼ（ALP）は、サンドイッチELISA法による分析物の検出に最も広く使用されている酵素であり、研究者の用途に応じて異なるオプションを提供します。

リン酸P-ニトロフェニル（pNPP）

pNPPはALP基質です。 pNPPの添加後、サンプルを室温で10〜30分間インキュベートします。 0.75M NaOHを加えて反応を停止し、405nmでサンプルを読み取ります。

過酸化水素

過酸化水素はHRPの基質であり、反応中に色が変化します。

TMB（3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン）

TMB は、HRPの存在下で過酸化水素が還元されると色が変化します。反応を停止するために硫酸を加えると、プレートリーダーで450nmの波長で測定できる色の変化が生じます。

結果の計算

次の式を使用して計算します。:

相対O.D.450 =（各ウェルのO.D.450）–（ゼロウェルのO.D.450)

標準曲線は、各スタンダードの相対O.D.450（Y）対、標準液の各濃度（X）としてプロットできます。サンプルの濃度は、標準曲線から決定できます。カーブエキスパート1.3などの専用ソフトウェアを使用することをお勧めします。

注：測定されたサンプルが希釈された場合、得られた濃度に希釈係数を掛け、希釈前の濃度に補正します。

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