多重ELISAプロトコル

GeniePlex Multiplex ELISAは、研究者がFlow Cytometryによってわずか15μLのサンプルで最大24個の分析物を定量化できるようにします！

多重ELISAプロトコル

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多重 ELISA プロトコルの概要

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多重ELISAプロトコルビデオ

テクニカル·マニュアル

1.) あなたの井戸にGenieplex抗体ビーズ結合を追加します。

2.) サンプルと規格を井戸に追加する。試料を室温で60分間培養する。その後、フィルタープレート真空システムを用いてプレートX3を洗浄する。

3.) ビオチン化抗体を加えて30分間培養します。その後、フィルタープレート真空システムを用いてプレートX3を洗浄する。

4.) ストレプトアビジン-PE溶液を加えて20分間培養します。その後、フィルタープレート真空システムを用いてプレートX3を洗浄する。

5.) 読み取りバッファを追加し、フローサイトメーターでサンプルを読み取ります。

6.) データを分析します。

多重 ELISA プロトコルの手順

Number	Steps
1.	フィルタプレートテンプレートを準備します。標準、サンプル、およびブランクウェルを表示します。標準とサンプルは、重複または3重コピーで実行する必要があります。プレート全体を使用しない場合は、未使用の井戸をプレートシールでシールします。重要:すべてのアッセイプロセス中にフィルタープレートをフィルタープレート蓋の上に置き、プレート底部が接触しないようにします。
2.	15秒間のボルテックス作動ビードサスペンション。
3.	各ウェルにキャプチャビーズ作業懸濁液45µLを追加する。メモ: 残りのキャプチャビード作業用サスペンションを保存し、2~8℃で保管してください。フローサイトメータの取得パラメータの設定に使用できます。
4.	フィルタープレート洗浄機の説明に従って調整された真空源に接続された「フロースルー」フィルタープレート洗浄機を使用して、ウェル内のバッファを除去します。
5.	バッファの「フロースルー」除去後に残ったバッファを取り除くには、プレート底を数層のペーパータオルに軽くたたいてください。
6.	各試料に30μLのCCS、SPBまたはTLアッセイバッファを添加する。メモ: 細胞培養上清サンプルは、非常に低いレベル（20 pg/mL未満）のサイトカインが予想される場合、アッセイバッファで希釈することなく実行できます。その場合は、この手順を省略し、ステップ 7 で各サンプルに 45 µL の細胞培養上澄みサンプルを追加します。
7.	各サンプルに15µLのサンプルをよく加えなさい。
8.	各標準ウェルに45µLの標準を追加します。
9.	プレートシールでプレートを覆いなさい。
10.	シェーカー（700rpmに設定）で室温で60分間インキュベートする。フィルタープレートをアルミホイルで包んで光から保護します。
11.	プレートシールを取外します。
12.	真空源に接続されたフィルタープレートワッシャーを使用して、ウェル内の溶液を除去する。
13.	フィルタプレートワッシャを使用して、100 µL 1x洗浄バッファでウェルを3回洗浄します。
14.	最後に洗浄した後、プレート底を数層のペーパータオルで軽くたたいて、プレート底に残っている緩衝材を取り除きます。
15.	それぞれの井戸にビオチン化抗体加工液25µLを添加する。
16.	プレートシールでプレートを覆いなさい。
17.	シェーカー（700rpmに設定）で室温で30分間インキュベートする。フィルタープレートをアルミホイルで包んで光から保護します。
18.	プレートシールを取外します。
19.	フィルタープレートワッシャーを使用して、ウェル内の溶液を除去する。
20.	フィルタプレートワッシャを使用して、100 µL 1x洗浄バッファでウェルを3回洗浄します。
21.	最後に洗浄した後、プレート底を数層のペーパータオルで軽くたたいて、プレート底に残っている緩衝材を取り除きます。
22.	各ウェルに25µLのストレプトアビジン-PE作業溶液を添加する。
23.	プレートシールでプレートを覆いなさい。
24.	シェーカー（700rpmに設定）で室温で20分間インキュベートする。フィルタープレートをアルミホイルで包んで光から保護します。
25.	プレートシールを取外します。
26.	フィルタープレートワッシャーを使用して、ウェル内の溶液を除去する。
27.	100µL 1x洗浄バッファで井戸を2回洗浄する。
28.	皿の底を数層のペーパータオルに軽くたたいて、残留液を取り除きます。 2フローサイトメーターのサンプルロードメカニズムに応じて、150µL~300µLの読み取りバッファを各ウェルに追加してビーズを再停止します。
29.	プレートシールでプレートを覆いなさい。
30.	プレートをマイクロタイターシェーカーの上に置き、700rpmで30秒間振ります。メモ: フローサイトメータに96ウェルプレートローダがなく、ビーズを再サスペンドするために読み取りバッファが200µL以上必要な場合は、プレートを振らないでください。 P200ピペットで上下6~8回ピペットを使用して各ウェルのビーズを再度吊り下げ、テストチューブに移し、入手します。
31.	プレートシールを取外します。
32.	フローサイトメーターで読みます。

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カスタム GeniePlex

事前製作のジニーフレックス

Multiplex ELISA の説明と原理

GeniePlex多重アッセイ技術は、大きさと異なるレベルの蛍光強度によって差別化された複数のビーズ母集団を利用する。複数の大きさのビーズと各ビーズサイズに複数のレベルの蛍光強度を備えたジニーフレックス技術は、一度の反応で最大24個の分析物を同時に測定することができます。反応中のビード集団は、単一の488nmレーザーまたはデュアル488nmおよび633/640nmレーザーを備えたフローサイトメーターによって決定されます。ビーズ分類染料の最大発光量は700nmである。

ビーズベースの免疫測定は、各ビーズ母集団がサイトカインなどの関心タンパク質を捕捉する特定の捕捉抗体と結合したサンドイッチELISAの原理に類似する。捕捉された分析物の量は、タンパク質の二次エピトープに対するビオチン化抗体を介して検出され、次いでストレプトアビジン-R-フィコエリトリン処理が行われます。ビーズ上のR-フィコエリトリンの蛍光強度をフローサイトメータで定量する。.

蛍光信号を既知の分析物濃度の直列希釈から生成される標準曲線の信号と比較することにより、試料中の注目タンパク質濃度を得ることができる。

アッセイ手順は、60分間の抗原および捕捉抗体共役ビーズインキュベーションステップと30分間のビオチン化検出インキュベーションステップと20分間のストレプトアビジンPEインキュベーションステップからなる。

Written by Colm Ryan

Colm Ryan PhD is a co-founder of Assay Genie. Colm carried out his undergraduate degree in Genetics in Trinity College Dublin, followed by a PhD at the University of Leicester. Following this Colm carried out a post-doc in the IGBMC in Strasbourg, France. Colm is now Chief Executive Officer at Assay Genie.