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細菌変換のガイド: 遺伝子操作の科学

細菌の形質転換は、細菌を遺伝子組み換えするために使用されるプロセスです。これはさまざまな方法で行うことができますが、最も一般的なのは、有能な細胞を使用することによるDNA媒介の変換です。このガイドでは、変換効率の計算方法と、変換効率に影響を与える要因を含む、細菌変換の基本について説明します。この強力な技術は、ワクチン開発、薬物発見、バイオテクノロジーなど、さまざまな用途で使用されています。

細菌の形質転換の図式

細菌の形質転換とは何ですか (Bacterial Transformation)？

細菌形質転換は、外来DNAを細菌細胞に挿入する過程であり、DNA媒介形質転換は、外来DNAを取り込みやすくする方法で処理された能力のある細胞を含みます。能力のある細胞が作られると、外来DNAが追加され、細胞は培養されます。その後、DNAは細胞内に入り、細菌ゲノムに組み込まれます。このプロセスは、バクテリアに新しい遺伝子や突然変異を導入するのに使用できます。

細菌の形質転換は、さまざまな目的に使用できる強力なツールです。最も一般的なアプリケーションの1つはワクチン開発です。病原体のDNAを細菌に導入することで、人間や動物にとって安全なワクチンを作ることができます。この技術は新薬の開発にも利用できます。バクテリアに突然変異を導入することで、抗生物質に耐性のある菌株を作ることができます。これは、新しい抗生物質を作成したり、既存の薬の有効性をテストするために使用できます。細菌の形質転換はバイオテクノロジーでも使用されています。このプロセスは、研究や産業で使用する酵素、ホルモン、その他のタンパク質を生成するために使用できます。

細菌の形質転換に関与するステップ

pBluプラスミドは、細菌の形質転換に使用できる市販のベクターである。このプラスミドにはβ-ガラクトシダーゼ (beta-galactosidase)の遺伝子が含まれており、容易に同定できます。 pBluプラスミドには抗生物質耐性マーカーも含まれており、これにより形質転換細胞を抗生物質が含まれた寒天板で選択することができます。各プレートの青いコロニーは変換が成功したことを示し、青いコロニーがないことは変換が成功しなかったことを示します。 pBluプラスミドを使用して有能な細胞を変換するには、次の手順に従います:

Step	Procedure
1.	電気泳動または熱衝撃のいずれかを使用して、適切な細胞を準備します。
2.	DNAを能力のある細胞に加え、37℃で30分間培養する。 DNAは、0.01~0.05ng/µlの濃度で適合細胞に添加する必要がある。
3.	抗生物質が入っている寒天プレートに細胞をプレートします。
4.	プレートを37℃で一晩培養する。
5.	プレート上に形成されるコロニーの数を数えてください。変換効率をパーセンテージで計算します。

一般的なリソース

CD Marker 案内する

B Cell 案内する

Sonication Protocol

変換効率はどのように計算されますか？

有能な細胞は、細胞膜をより外来DNAに浸透させるために遺伝子組み換えられた細菌細胞である。電気泳動と熱衝撃の2つの方法で、有能な細胞を作ることができます。エレクトロポレーションは、電場を利用して細胞をDNAにより浸透させるプロセスです。ヒートショックは、42℃に加熱された水浴で細胞を培養することを含みます。

形質転換効率とは、外来DNAを占める細胞の数を細胞総数で割ったものです。これは、抗生物質が入っているプレートに有能な細胞をメッキすることで計算できます。有能な細胞の変換効率を計算するには、寒天板に形成されるコロニーの数を数える必要があります。これは、既知の数の細胞をめっきし、一夜にして培養することで可能です。変換効率は、形成されるコロニーの数をメッキされた細胞の数で割ったものとして計算されます。変換効率は通常、パーセンテージで表されます。

変換効率に影響を与える要因は何ですか？

変換効率に影響を与える要因はいくつかあります。これらには、使用される適格な細胞の種類、DNA濃度、潜伏期間と温度、選択圧力および使用方法が含まれます。

1.) 適格な細胞

有能な細胞は、細菌の形質転換を成功させる鍵です。異なるタイプのセルは、異なる変換効率を持つことができます。例えば、大腸菌の能力を持つ細胞は、約1000万分の1の形質転換効率を有する。これは、100万個の大腸菌細胞ごとに、外来DNAを占めるのは1個だけであることを意味します。

2.) DNA濃度

DNAの濃度は変換効率にも影響を与える可能性があります。濃度が低すぎると、有能な細胞はDNAを十分に取り込むことができず、形質転換に成功する可能性があります。濃度が高すぎると、有能な細胞がDNAを取り込みすぎて過負荷になることがあります。

3.) 培養時間と温度

潜伏期間や気温も重要な要素です。細胞があまりにも長く培養されると、DNAが劣化する可能性があります。温度が高すぎると細胞死に至る。最適な培養時間と温度は、使用される適合細胞のタイプによって異なります。

4.) 選択圧力

選択圧力も重要な要素です。これは形質転換された細胞が成長する条件を意味します。選択圧が高すぎると、外国のDNAを取り込んだ細胞だけが生き残ることができます。これにより、変換効率が低下する可能性があります。

5.) 方法

有能なセルを作成するために使用される方法は、変換効率に影響します。電気泳動は、熱衝撃よりも効率が高く、最大90 %の効率を実現します。熱ショックは効率が低く、約50~70 %の効率を実現します。

細菌の形質転換に使用できる市販の有能な細胞がいくつかあります。 DH適合細胞は大腸菌K12株に由来し、約1000万分の1の形質転換効率を有する。 XL適合細胞は大腸菌XL-lacZ株に由来し、約1億分の1の形質転換効率を有する。これらの有能な細胞は、高い変換効率を持つように設計されています。これらの能力のあるセルの一部を使用すると、最大 90% の変換効率を達成できます。

Written by Colm Ryan

Colm Ryan PhD is a co-founder of Assay Genie. Colm carried out his undergraduate degree in Genetics in Trinity College Dublin, followed by a PhD at the University of Leicester. Following this Colm carried out a post-doc in the IGBMC in Strasbourg, France. Colm is now Chief Executive Officer at Assay Genie.