TUNEL 染色 : 細胞死を測定するための最適な方法
この記事では、TUNEL 染色アッセイについて知っておくべきことをすべて説明します。まず、TUNEL 染色とは何か、またその仕組みについて説明します。
次に、利用可能なさまざまな種類の TUNEL 染色について説明します。次に、他のアポトーシスアッセイと比較した TUNEL 染色の利点を見ていきます。
最後に、TUNEL 染色を正しく実行するためのヒントをいくつか紹介します。
重要なポイント
TUNEL アッセイは、DNA 鎖の切断と蛍光色素による標識を通じてアポトーシス細胞を検出します。
正確な結果を得るには、細胞の適切な固定と透過処理が不可欠です。
2 種類の TUNEL 染色: FITC-dUTP (高感度) と PI-dUTP (光退色耐性)。
DAPI による対比染色は、アポトーシスを起こした核を区別するのに役立ちます。
TUNEL 染色は高感度で、固定細胞で機能し、他の染色と組み合わせて包括的な分析を行うことができます。
信頼性の高い結果を得るには、新鮮な細胞と試薬、希釈した染色液、および最適化された条件が不可欠です。
TUNEL アッセイの原理
TUNEL アッセイは、アポトーシス、つまり細胞死の原理に基づいています。アポトーシスは、細胞がもはや機能できない状況から脱するために自己破壊するプロセスです。アポトーシスが起こるためには、細胞はまず DNA 損傷を受けなければなりません。 DNA 損傷が発生すると、細胞はカスパーゼとして知られる酵素を活性化します。カスパーゼは、特定の部位で DNA を切断する酵素ファミリーです。 TUNEL 細胞死アッセイは、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ (TdT) として知られる酵素を使用することにより、この事実を利用します。
TdT は、カスパーゼによって切断された DNA 鎖の末端を認識して結合することができます。 TdT が DNA に結合すると、DNA 鎖の末端へのヌクレオチドの付加を触媒します。このプロセスはニックトランスレーションとして知られています。ヌクレオチドの追加により DNA 鎖に新しい末端が作成され、蛍光色素を使用して検出できます。これがTUNEL染色の原理です。
TUNEL 1ステップキット
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TUNEL 染色プロトコル
TUNEL 染色を実行するときは、細胞が適切に固定され、透過化されていることを確認することが重要です。これは、細胞をパラホルムアルデヒドなどの固定液中で少なくとも 30 分間インキュベートすることによって行うことができます。次に、染色前に細胞を Triton X-100 などの界面活性剤で透過処理する必要があります。 TUNEL アッセイを使用してアポトーシス細胞を検出するために従う手順は次のとおりです。
- 細胞をパラホルムアルデヒド中で 30 分間固定します。
- Triton X-100 による透過処理
- TUNEL 反応混合物中で 60 分間インキュベートします
- PBS ですすぎ、Prolong Gold Antifade Reagent などの封入剤を使用してスライドに封入します。
- 励起波長 405 nm、発光波長 525 nm を使用した蛍光顕微鏡で観察
TUNEL 汚れの種類
利用可能な TUNEL 染色には 2 種類があります。 FITC-dUTP は感度が高く、使いやすいため、最も一般的に使用される染色剤です。 PI-dUTP は感度は低いですが、光退色に対して耐性があります。
TUNEL 染色を実行する場合、DAPI などのネガティブ染色を使用してアポトーシス核を対比染色することが重要です。これは、アポトーシス細胞のみを確実に検出するのに役立ちます。 TUNEL アッセイはアポトーシスに特異的ではなく、壊死細胞も検出することを覚えておくことが重要です。偽陽性を回避するには、スタウロスポリン処理細胞などの陽性コントロールを使用することが重要です。
アポトーシス細胞を検出するために、dUTP の代わりにストレプトアビジン-ビオチン複合体を使用することもできます。この方法では、TUNEL 反応混合物にビオチンタグ付きヌクレオチドが使用されます。次に、ストレプトアビジン-ビオチン複合体を使用してビオチンタグに結合します。ビオチンタグ付きヌクレオチドは分解に対してより耐性があり、より強いシグナルを生成します。この方法は、FITC-dUTP または PI-dUTP を使用するよりも感度が高くなりますが、高価でもあり、それほど広く利用可能ではありません。
TUNEL アッセイの利点
TUNEL 染色を使用することには、他のアポトーシス アッセイに比べていくつかの利点があります。最初の利点は、フローサイトメトリーや免疫組織化学などの他の方法と比較した場合、TUNEL 染色は感度が高く、特異的であり、使いやすいことです。これは、TUNEL 染色を使用して、細胞が広範な DNA 損傷を受ける前の、より早い段階でアポトーシスを検出できることを意味します。
TUNEL 染色のもう 1 つの利点は、固定細胞に使用できることです。これは、生細胞イメージングを実行する必要がないことを意味します。生細胞イメージングは実行が難しく、多くの場合高価な機器が必要となるため、これは大きな利点です。これは、生細胞に対してのみ使用できるアネキシン V アッセイなどの他のアポトーシス アッセイに比べて重要な利点です。さらに、TUNEL 染色は光退色に耐性があり、さまざまな種類の細胞に使用できます。
最後に、TUNEL 染色をダピやヨウ化プロピジウムなどの他の染色と組み合わせて使用すると、細胞のより完全な画像を作成できます。ダピまたはヨウ化プロピジウムのみを使用して DNA 損傷を検出するのは難しい場合があるため、これはアポトーシスの初期段階を調査する場合に特に役立ちます。
TUNEL 染色を最適化するためのヒント
TUNEL 染色を実行する際には、留意すべき重要なヒントがいくつかあります。
まず、新鮮に単離された細胞を使用することが重要です。これは、アポトーシス細胞は急速に分解し、細胞が新鮮でないと検出が困難になる可能性があるためです。 TUNEL 染色を行う場合は、新鮮な試薬を使用することも重要です。長期間保存された試薬は効果がない可能性があり、偽陰性結果が生じる可能性があります。
次に、希釈した TUNEL 染色液を使用することが重要です。これは、細胞が正しく染色され、偽陽性が検出されないことを確認するのに役立ちます。第三に、染色反応を最低 15 分間継続することが重要です。最後に、未結合の TUNEL 染色を除去するために、染色後に細胞を徹底的に洗浄することが重要です。
最良の結果を得るには、染色条件を最適化する必要があります。これには、多少の実験と試行錯誤が必要になる場合があります。このブログで説明されているヒントに従うことで、TUNEL アッセイで正確で信頼性の高い結果が得られることを確認できます。これで、TUNEL 染色に関する包括的なガイドは終わりです。有益でお役に立てば幸いです。
4th Nov 2024
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