細胞を解凍する方法: 細胞培養を成功させるためのベストプラクティス

細胞を解凍する方法: 細胞培養を成功させるためのベストプラクティス

細胞培養技術は生物医学研究の基礎であり、細胞機能、創薬、疾患メカニズムについての重要な洞察を提供します。細胞培養における重要なステップは細胞の解凍プロセスであり、これが正しく実行されないと、細胞の生存率や実験結果に悪影響を与える可能性があります。この包括的なガイドでは、細胞培養を確実に成功させるための細胞解凍のベスト プラクティスについて概説します。


細胞解凍の基本を理解する

細胞の解凍は、凍結保存された細胞を温めて代謝活動を再開するプロセスです。凍結保存は、細胞を極低温で保存して代謝を停止し、遺伝子的および構造的完全性を保存するために使用される方法です。細胞の解凍プロセスは繊細であり、細胞ストレスを最小限に抑えて高い生存率を確保するには正確な取り扱いが必要です。


急速解凍の重要性

急速な解凍は、細胞膜や細胞小器官に機械的損傷を引き起こす可能性がある細胞内での氷の結晶の形成を最小限に抑えるために非常に重要です。最適な解凍速度は一般に 1 分あたり 37°C であると考えられており、この速度は有害な氷の結晶が形成される温度範囲をすぐに超えます。


細胞を解凍するためのステップバイステップガイド

準備
解凍プロセスを開始する前に、37°C​​ に設定したウォーターバス、ピペット、培地、個人用保護具 (PPE) などのすべての材料が準備されていることを確認してください。温度を平衡化するために、適切な培地を事前に 37°C に温めてください。


解凍プロセス
クライオバイアルを液体窒素貯蔵タンクから 37°C のウォーターバスに素早く移します。汚染を避けるためにバイアルのキャップを浸さないように注意しながら、均一に解凍するためにウォーターバス内でバイアルを静かに旋回させます。氷が溶けて細胞が解凍されたことを示したら、過熱を防ぐためにすぐにバイアルをウォーターバスから取り出します。


希釈と移送
解凍した細胞懸濁液を、あらかじめ温めた培地が入った滅菌遠心管に移します。このステップでは、室温で細胞に対して毒性を示す可能性がある凍結保護剤、通常はジメチルスルホキシド (DMSO) を希釈します。
細胞を遠心分離してペレットにし、上清を注意深く除去し、細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁します。


文化と復興
細胞懸濁液を培養フラスコに移し、細胞の種類に適した条件下でインキュベートします。これにより、細胞が解凍プロセスから回復し、通常の代謝活動を再確立することができます。


表: 主要な手順、アクション、ヒント。

ステップ
主要なアクション
ヒント
準備
材料を集め、培地を温めます。
開始する前に、すべての材料が準備ができており、正しい温度であることを確認してください。
解凍プロセス
クライオバイアルを 37°C のウォーターバスに移し、バイアルのキャップが水に浸からないようにしながら、静かに旋回させます。
急速解凍が重要です。細胞がウォーターバス内で過ごす時間を最小限に抑えます。
希釈と移送
凍結保護剤を温かい培地で希釈し、遠心分離し、新鮮な培地に再懸濁します。
凍結防止剤を素早く希釈して除去し、毒性を最小限に抑えます。
文化と復興
細胞を培養フラスコに移し、インキュベートし、回復を監視します。
細胞の種類に基づいて培養条件を調整し、細胞の健康状態を注意深く監視します。

解凍後のケア

解凍後、細胞は通常の成長と動作を再開するまでに一定期間の回復が必要な場合があります。細胞の接着 (接着している場合)、生存率、および形態を定期的に監視します。健康な細胞の増殖を促進するために、必要に応じて培養条件を調整します。


一般的な問題のトラブルシューティング

低い細胞生存率
解凍後の細胞生存率の低下は、凍結保護剤への長時間の曝露、解凍速度の遅さ、最適ではない凍結保存技術など、いくつかの要因によって発生する可能性があります。解凍プロトコルを改善し、凍結防止剤の迅速な希釈と除去を確実に行うことで、細胞の生存率を高めることができます。


汚染
解凍プロセス中、特にバイアルのキャップがウォーターバスに浸されている場合、汚染のリスクがあります。無菌技術を使用し、ウォーターバスと作業面を清潔に保つことで、このリスクを軽減できます。


結論

凍結保存した細胞の解凍は細胞培養において重要なステップであり、細部まで細心の注意を払う必要があります。このガイドで概説されているベスト プラクティスに従うことで、研究者は細胞の生存率を最大化し、細胞培養実験を確実に成功させることができます。細胞解凍を成功させる鍵は、細胞を迅速かつ丁寧に取り扱うこと、凍結保護剤を適切に希釈すること、および回復段階で注意深くモニタリングすることにあることを覚えておいてください。


参考文献

R. I. フレッシュニー (2016)。動物細胞の培養：基本技術と特殊な応用のマニュアル（第 7 版）。ワイリー＝ブラックウェル。
マスターズ、J.R. (2000)。動物細胞培養: 実践的なアプローチ (第 3 版)。オックスフォード大学出版局。
ペッグ、D.E. (2007)。冷凍保存の原則。イン・デイ、J.G.、ステイシー、G.N. (編)、凍結保存および凍結乾燥プロトコル (第 2 版、39 ～ 57 ページ)。ヒューマナプレス。
フラー、B.J. (2010)。凍結保護剤: 凍結状態で生命を保護するために不可欠な不凍液。 CryoLetters、31(4)、231-244。
Fahy, G.M.、MacFarlane, D.R.、Angell, C.A.、および Meryman, H.T. (1984)。凍結保存へのアプローチとしてのガラス化。冷凍生物学、21(4)、407-426。
デイ、J.G.、ステイシー、G.N. (2008)。バイオバンキング。分子バイオテクノロジー、40、202-213。
16th Dec 2024 Sana Riaz

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