血球計数器による細胞計数精度の向上: 包括的なガイド
細胞計数はさまざまな科学実験の重要な部分であり、研究者が細胞集団とその特徴に関する重要なデータを収集できるようになります。このステップバイステップのガイドでは、正確な細胞計数を達成し、細胞生存率を決定するための、トリパンブルー染色と組み合わせた血球計数器の利用法について詳しく説明します。
ノイバウアー細胞チャンバーは血球計数器とも呼ばれ、細胞計数と生存率評価の分野において多用途で不可欠なツールとして機能します。この血球計数器は、計数チャンバーとカバー スリップという 2 つの一体型コンポーネントで構成されており、正確な細胞定量のための包括的なソリューションを提供します。計数室は独特の正方形の形状を示し、さらに小さな正方形または長方形のグリッドに分割されます。これらのグリッド線は、計数プロセス中に細胞の系統的かつ組織的な配置を維持するのに役立ち、効率的かつ正確な定量化を可能にします。
透明なガラスまたはプラスチック片であるカバースリップは、計数チャンバーの上に配置され、保護バリアとして機能し、細胞を所定の位置に保持します。細胞の動きや変位を防ぎ、分析中ずっと細胞が指定された計数領域内に留まるようにします。この制御された環境は、信頼性が高く再現性のある細胞数を取得するために重要です。
血球計数器とトリパンブルー染色を利用することで、研究者は細胞の生存率について貴重な洞察を得ることができます。生体色素であるトリパンブルーは、生細胞と死細胞を区別するために一般的に使用されます。この色素は、生存不能または損傷した細胞の膜に選択的に浸透して青く染色しますが、無傷の膜を持つ生細胞は色素を排除し、染色されないままになります。この染色技術は、特定の集団内の生存細胞の割合を評価する手段を提供します。
血球計にロードするための細胞の処理
最初のステップでは、正確に計数するために細胞懸濁液を準備します。血液や培養液などの液体サンプルの場合、細胞を統合するために遠心分離が必要です。遠心分離後、得られた細胞ペレットを少量の生理食塩水または水に再懸濁します。逆に、組織切片や培養細胞単層などの固体サンプルの場合は、サンプルを計数チャンバーに直接置くだけで十分です。
細胞をチューブに移し、明確な視認性と計数に十分な量（少なくとも 25 ～ 50 個の細胞）を確保します。
細胞懸濁液を 1000 RPM で 5 分間遠心分離し、細胞の沈降とチューブの底への接着を促進します。
チューブの底にある細胞ペレットを乱さないように注意しながら、デカンテーションによって上清（細胞ペレットの上の液体）を注意深く除去します。
500 μL の PBS (リン酸緩衝生理食塩水) を加えて細胞を再懸濁し、ゆっくりとかき混ぜて完全に混合します。
血球計算板の準備
血球計数器は、表面に精密にエッチングされたグリッドを備えた顕微鏡スライドを備えた細胞計数装置として機能します。このグリッドは、定義された領域内のセルを数えるためのフレームワークを提供します。
ノイバウアー細胞計数チャンバーをトリパン ブルー溶液で満たすことから始めます。トリパンブルー溶液は、ノイバウアー細胞計数チャンバーの「0.04mm」とラベルされた線まで満たされる必要があります。
次に、細胞サンプルをノイバウアー細胞計数チャンバーに導入します。正確なカウントを可能にするために適切な数のセルを確保してください (少なくとも 25 ～ 50 セル)。
ノイバウアー細胞計数チャンバーをゆっくりと回転させ、細胞サンプルとトリパン ブルー溶液の混合を促進します。
細胞計数手順
まず、ノイバウアー細胞計数チャンバーを顕微鏡スライド上に慎重に配置し、顕微鏡のレンズがチャンバーのグリッド線の方向を向いていることを確認します。
顕微鏡の焦点を調整して、ノイバウアー細胞計数チャンバー内のグリッド線を明確に視覚化します。個々の細胞がグリッド内で識別できるようになり、正確な計数が可能になります。
象限やセクターなどの指定された対象領域内に存在するセルの数を体系的にカウントし、カウント プロセスの精度と一貫性を確保します。
ノイバウアー細胞計数チャンバー内の残りの領域に対してこの細心の注意を払った計数手順を繰り返し、関連するすべての領域を体系的にカバーします。
特定の体積内の白血球 (WBC) の数を推定するには:
WBC 希釈係数 (DF) を計算します。これには、ノイバウアー細胞計数チャンバー内の細胞の総数を、そのチャンバー内で計数された WBC の数で割ることが含まれます。
各ノイバウアー細胞計数チャンバーに存在する白血球の数を数えます。チャンバーごとに観察された WBC の数に WBC の希釈係数を掛けます。この計算により、元のサンプルの mL あたりの細胞数が得られます。
特定の体積内の赤血球 (RBC) の数を推定するには:
白血球と赤血球の両方を含む、ノイバウアー細胞計数チャンバー内に存在する細胞の総数を数えます。
カウントされた RBC の数を観察された細胞の総数で割ることにより、サンプル中の RBC の割合を計算します。
サンプル中の赤血球の割合に元のサンプルの体積を掛けます。この計算により、元のサンプルに存在する RBC の総数の推定値が得られます。
トリパンブルー細胞生存率アッセイ
トリパンブルーは、生細胞を染色するために使用される色素です。色素が細胞に結合すると、細胞は青色になります。これにより、生細胞と死細胞を簡単に区別できます。生細胞はトリパンブルーを取り込みますが、死んだ細胞は取り込みません。
- 細胞生存率を計算するには、カウントされた細胞の総数と生細胞 (トリパン ブルーで染色) の数を知る必要があります。
- 細胞生存率の計算式は次のとおりです: 細胞生存率 % = (生細胞数/細胞総数) x 100。
- たとえば、100 個の細胞を数えて 30 個の生細胞があった場合、細胞生存率は次のようになります: (30/100) x 100 = 30%。
- 死細胞の割合を計算するには、同じ式を使用しますが、「生細胞の数」を「死細胞の数」に置き換えます。
血球計数器での細胞計数の効率を向上させるためのヒント
- ノイバウアー細胞計数チャンバーの複数の領域で細胞を計数し、サンプル内の細胞数をより正確に推定します。
- すべてのカウントにノイバウアー細胞計数チャンバーの同じ領域を使用するようにしてください。これにより、測定をより正確かつ一貫して行うことができます。
- ノイバウアー細胞計数チャンバーを使用してサンプル内の細胞を計数する場合は、少なくとも 40 倍の倍率の顕微鏡を使用することが重要です。これにより、グリッド内の個々のセルを表示できるようになります。
- 細胞を染色するには、少量のトリパン ブルーをサンプルと混合し、少なくとも 5 分間放置します。カバースリップ上の細胞を傷つけないように注意してください。
- デジタル カメラ付き顕微鏡を使用して、ノイバウアー細胞計数室の写真を撮ります。これにより、手動でセルをカウントする必要がなくなり、時間を節約できます。
- 細胞計数ソフトウェア プログラムを使用して、細胞計数プロセスを自動化します。これは、特に多数のセルを数えている場合に、リアルタイムの節約になります。
ノイバウアー細胞計数チャンバーは、細胞を計数し、細胞の生存率を判断するために使用できる便利なツールです。この記事がお役に立ち、自信を持って血球計数器を使用できるようになりましたら幸いです。あなたなりのヒントはありますか？それらを私たちと共有してください。
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