脂肪酸酸化キット
Fatty Acid Oxidation Assay
Kitは、細胞や組織の脂肪酸酸化を定量的に測定するための高感度の比色分析キットです。
この独自のアッセイでは、溶解性の高いオクタノイルCoA基質を利用して、18C不飽和脂肪酸オレイン酸などの長鎖の不溶性基質に対する脂肪酸酸化の正確な測定を可能にします。
| アッセイタイプ： |
細胞ベース（定量的） |
| 検出方法： |
測色 |
| プラットホーム: |
マイクロプレートリーダー |
| サンプルタイプ： |
細胞と組織 |
| アッセイ溶液 |
5 ml (for 100 wells) |
-70°C (アッセイ中は溶液を光から保護します) |
| 基板 |
20x - 0.25 ml |
-70°C |
| 細胞溶解のためのソリューション |
10x - 25 ml |
-4°C |
脂肪酸の酸化
脂肪酸は、グルコースなどの炭水化物よりも炭素あたりのATPを多く提供します。
心臓組織などのエネルギー要件の高い組織では、エネルギーの最大50〜70％が脂肪酸のベータ酸化に由来し、ミトコンドリアは同時にFADH2とNADHを生成して、脂肪酸をアセチルCoAに変換します。
この厳密に好気性の酸化経路は、アシル-CoAデヒドロゲナーゼによるアシル-CoA脱水素、エノイル-CoAヒドラターゼによる水和、3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼによる脱水素、およびベータ-ケトチオラーゼによるチオール分解切断である。
これは、4つの異なるステップで構成されています。
脂肪酸酸化を研究することの重要性
ヒトのベータ酸化システムの重要性は、脂肪酸輸送と酸化欠陥の不均一なグループ、常染色体遺伝性脂肪酸酸化障害（FAOD）として分類される遺伝病のグループの存在によって示されます。
それはますます劣性の障害と広範囲の臨床症状を示します。
さらに、証拠は、胎児の発育中のFAO活動の調節が胎児の生活にとって重要であるだけでなく、成人の健康と病気にも影響を与えることを示しています。
したがって、FAO活動の測定は、多くの疾患の病態生理学的および代謝的基盤に対する貴重な洞察を提供します。
私たちの非放射性FAOアッセイは、基質のオクタノイル-CoAの酸化に基づいています。
NADHの生成は、テトラゾリウム塩INTのホルマザンへの還元に関連しています。
赤いホルマザンの強度は、FAO活動の増加に比例します。
アッセイ溶液と基質は-80°Cで分注する必要があります。
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キャプション 1:
脂肪酸酸化アッセイ:
組織溶解物は、健康なハムスターの心臓と心不全に関連するTO2ハムスターモデルの心臓から調製されました。
溶解物は、脂肪酸酸化のレベルを定量化するためのアッセイで使用されました。
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キャプション 2:
脂肪酸酸化アッセイ：オクタノイル-CoAは基質であり、反応の生成物ではありません。
図をご覧ください。
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細胞/組織抽出物の調製
| 1. |
氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で約106個の細胞を2回すすぎ、細胞ペレットからPBSを完全に除去します。
細胞ペレットは-80°Cで保存する必要があります。組織サンプルは、血球を除去するためにPBSで完全に洗浄する必要があります。
これにより、アッセイ結果に一貫性がなくなる可能性があります。
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| 2. |
10x Cell Lysis Solutionを氷冷dH2Oで希釈して、十分な1x Cell
LysisSolutionを調製します。 50〜100 µlの氷冷1x Cell
LysisSolutionを細胞ペレットに加えます。
上下にピペッティングして細胞を抽出します（穏やかですが完全に）。
ライセートを氷上に5分間置き、断続的に穏やかに攪拌します。
ライセートが粘性のある場合は、1x Cell Lysis
Solutionを加え、ピペッティングを繰り返します。
冷蔵マイクロフュージでライセートを最高速度で5分間遠心します。
アッセイのために上清を収集します。 組織を1xCell Lysis
Solutionでホモジナイズし、ライセートを遠心分離で清澄化します。
組織のホモジナイゼーションには、0.5mlの1xCell
LysisSolutionあたり約25mgの組織を使用します。
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| 3. |
タンパク質アッセイを実行して、サンプルのタンパク質濃度を決定します。
氷冷した1xCell Lysis Solutionで1〜3 mg /
mlに希釈して、サンプルタンパク質濃度を標準化します。
タンパク質サンプルは常に氷上に保管してください。
凍結融解した粗タンパク質ライセートは、酵素活性の低下を示す場合があります。
ライセートは-80°Cで保存する必要があります。注:還元剤またはSDSを含むバッファーは使用しないでください。
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解凍試薬:
解凍したFAOアッセイ溶液と20xFAO基質を氷上に置きます。
ピペッティングする前に、溶液を静かに攪拌します。
試薬が解凍される時間を最小限に抑えることが重要です。
使用後すぐに溶液を凍結します。
対照溶液および反応溶液の調製:
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対照溶液は、1部のdH2Oを20部のFAOアッセイ溶液と混合することによって調製されます。
25 µlのdH2Oを500 µlのFAOアッセイ溶液と混合します。
アッセイ中は、新たに調製した対照溶液を氷上に保存します。
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反応溶液は、1部の20xFAO基質を20部のFAOアッセイ溶液と混合することによって調製されます。
25 µlの20xFAO基質を500µlのFAOアッセイ溶液と混合します。
溶液を氷上に置き、すぐに使用します。
各タンパク質サンプルは、2つの別々のセットで50 µlのコントロール溶液と50
µlの反応溶液で処理されます。
| 1. |
各タンパク質サンプル10µlを96ウェルプレートに2回ずつ加えます。
注:創薬アプリケーションの場合は、両方のウェルに1
µlの薬物阻害剤を加え、上下にピペッティングしてサンプルと混合します。
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| 2. |
すべてのサンプルをプレートにピペッティングした後、50
µlのコントロール溶液を1セットのウェルに、50
µlの反応溶液を別のセットのウェルにすばやく加えます。
内容物を穏やかに攪拌しながら30秒間混合します。
プレートを覆い、加湿した37℃のインキュベーターで1〜2時間インキュベートします。
FAOの活動により、井戸はチェリーレッド色になります。
CO2インキュベーターは使用しないでください。
注：赤がほとんど検出されない場合は、サンプルタンパク質濃度および/またはインキュベーション時間を増やしてください。
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| 3. |
各コントロール溶液ウェルと反応溶液ウェルに3%酢酸(キットには含まれていません)50
µlを加え、穏やかに穏やかに攪拌してアッセイを停止します。
プレートリーダーを使用して、外径492nmを測定します。
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| 4. |
各サンプルの反応ウェルの読み取り値からコントロールウェルの読み取り値を差し引きます。
差し引かれた外径の読みは、サンプルの脂肪酸酸化活性に比例します。
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1) 細胞でテストしましたか？ そうでない場合、10 ^
6が正しい数であることをどのように知っていますか?
使用量を減らしてもらえますか?
FAO活性はミトコンドリア含有量によって駆動されるため、ほとんどの培養細胞は低いが検出可能なFAO活性を示します。
FAO検出用の濃縮タンパク質抽出物を作成するには、10 ^ 6個の細胞が必要です。
2) アッセイは凍結組織で機能しますか?
アッセイは機能するために反応性酵素に依存していますか?
このアッセイは凍結組織で機能します。 酵素活性アッセイです。
3) 結果を決定するための標準曲線をどのように生成しますか?
アッセイの標準曲線はありません。
光学密度は酵素単位に変換できます。
4) FAOにはどのような阻害剤を使用できますか?
FAO阻害剤はテストされていません。
5) 特に培養細胞を用いたアッセイでは、どのコントロールをお勧めしますか?
ミトコンドリア含有量の高い細胞/組織は、ポジティブコントロールとして使用できます。
6) このアッセイは全血サンプルまたは精製PBMCで機能しますか?
サンプルの赤色は、492nmでの光学的検出を妨害します。
PBMCは、血球がない場合、標準プロトコルを使用して処理できます。
7) これは、植物材料の細胞や組織の脂肪酸酸化を測定できますか?
このアッセイは植物細胞でテストされていませんが、これは免疫学的アッセイではなく化学的アッセイであるため、機能すると思います。
8) このアッセイは細胞外液で機能しますか?
このアッセイは細胞外液では機能しません。
9) 長鎖FAはどうですか?
アッセイの基質として長鎖脂肪酸をテストしました。
ただし、長鎖脂肪酸の水溶性が低いと、アッセイ結果の信頼性が低下するという問題が発生します。
10) 長鎖FAの測定はFAOのより正確な決定ですか?
短いものと中程度のものはミトコンドリアCPTを必要としませんが、長いものは必要とします。
いいえ、CPTは、ミトコンドリア構造が維持されている無傷の臓器/細胞システムにのみ関連します。
ただし、FAOアッセイは組織/細胞ホモジネートの使用に基づいているため、CPTの活性をinvitroアッセイシステムで測定することはできません。
11)
キットは、NADH産生とオクタノイルCoAを、内因性組織基質(グリコーゲン、トリグリセリドなど)からのNADH産生とどのように区別しますか?
プロトコルに従って調製された対照溶液は、内因性組織基質からのNADH産生を測定します。
次に、対照溶液で得られた光学密度が、FAO活性の最終計算で差し引かれます。
12) 基準があるようには見えません。 FAOの活動が計算されます。
30と60で測定するだけの場合、30分でΔODを生成するにはどうすればよいですか?
時間0でも測定しますか?
30、60、90、または120分で反応を停止せずにODを測定できます。
13.
10x細胞溶解液の底には、溶解していないように見える白い沈殿物がたくさんあります。
物事を再溶解するために溶液を温めるべきですか?
はい、それはドライアイスの凍結によって引き起こされます。
攪拌しながら溶液を温めるだけです。
| Standage et al. |
NMR-based serum and urine metabolomic profile reveals suppression of
mitochondrial pathways in experimental sepsis-associated acute kidney
injury
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American Journal of Physiology-Renal Physiology
(2021)
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Pub Med: 33843271
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健康および病的状態（脂質代謝）における代謝経路およびプロセスの研究。
- シグナル伝達経路の研究。
- 遺伝性疾患の研究（例： 脂肪酸酸化障害(FAOD)*。
- 心血管疾患の研究（例： 心不全。
- 胎児の発育中の細胞エネルギー代謝の研究。
- 癌代謝における脂肪酸酸化の意味。
*これは研究用のキットであり、人間の病気の診断には使用できません。
反応終了のために3%酢酸溶液を調製する必要があります。
アッセイ溶液には、DMSOとヨードニトロテトラゾリウムバイオレットが含まれています。
MSDS情報については、当社ウェブサイトの製品ページを参照するか、お問い合わせください。
